Sanger-sekvensering

Sanger-sekvensering er en mye brukt metode for sekvensering som benyttes for å kunne lese av rekkefølgen på bokstavene (baseparene) i DNA. Målet med DNA-sekvensering er å få tilgang til organismens genetiske kode.

Sanger-sekvensering eller dideoksysekvensering er oppkalt etter Frederick Sanger som utviklet metoden. Dette er i dag omtalt som førstegenerasjons sekvensering.

Metode

I denne teknikken benyttes et enzym kalt DNA-polymerase, som i reagensrøret kan lage en kopi av en DNA-bit (templatet). En kort DNA-tråd (et syntetisk oligonukleotid) benyttes som en slags starter (kalt primer) og bestemmer hvor kopieringen skal begynne.

Som byggesteiner benyttes de fire deoksyribonukleosidtrifosfatene (dATP, dTTP, dGTP og dCTP), men man tilsetter også en tilsvarende men modifisert versjon, en analog, av en av disse. Denne mangler hydroksygruppen i 3-stilling i deoksyribosegruppen. Dette dideoksynukleosidtrifosfatet vil innføres i den voksende DNA-tråden i konkurranse med det tilsvarende normale nukleosidtrifosfatet.

Voksende DNA-tråder som har fått innført analogen, vil ikke kunne vokse videre fordi det ikke er mulig å feste nye byggesteiner (deoksyribonukleosidtrifosfater) til kjeden på grunn av den manglende hydroksygruppen på den modifiserte dideoksynukleosidtrifosfatet.

Resultatet av reaksjonen vil altså bli at man får dannet en serie med DNA-fragmenter som alle begynner i samme primersete og som avsluttes av samme dideoksynukleotid. Baserekkefølgen i det tilsatte templat-DNA-et vil bestemme i hvilke posisjoner dideoksynukleotidet kan innføres og derved størrelsen av DNA-fragmentene som dannes.

Fragmentstørrelsene kan bestemmes ved at man skiller fragmentene fra hverandre ved elektroforese. Ved å utføre fire forskjellige reaksjoner, hver med ett av de fire dideoksyribonukleosidtrifosfatene til stede, og analysere de fire reaksjonene ved elektroforese, vil man observere en såkalt sekvensstige hvor baserekkefølgen i DNA-tråden kan avleses direkte.

For at man skal kunne oppdage fragmentene, må de være merket. Tidligere benyttet man radioaktiv merking, men nå bruker man vanligvis fluorescensmerking (se DNA-probe).

Det er også mulig å benytte alle fire dideoksynukleotidene samtidig slik at en kan kjøre én og ikke fire reaksjoner. Da må DNA-polymerase utfører syntese i en lang nok periode til at man er sikker på at det finnes et dideoksynukleotid ved hver base av DNA-templatet.

Resultatet vil være det samme, at man får dannet en serie med DNA-fragmenter som alle begynner i samme primersete og som avsluttes med ett dideoksynukleotid som er merket med fluorescens.

Fragmententene skilles også her fra hverandre med elektroforese, og deretter kan de avleses fra et kromatogram.

Videre bearbeiding og bruk

Etter at sekvenseringen er ferdig, er det lurt å bruke bioinformatiske verktøy for å kvalitetssikre sekvensen.

Deretteter kan en bruke resultatet til en rekke undersøkelser, alt etter hva man er ute etter. DNA-sekvenser brukes blant annet til å studere genetikk, komparativ genomikk, fylogeni, populasjonsgenetikk, medisinsk forskning og lignende.

Les mer i Store norske leksikon

Kommentarer

Kommentaren din publiseres her. Fagansvarlig eller redaktør svarer når de kan.

Du må være logget inn for å kommentere.

eller registrer deg