polymerasekjedereaksjon

Polymerasekjedereaksjon (PCR) er en metode for enzymatisk amplifikasjon, det vil si mangfoldiggjøring av DNA, som gjør at spesifikke DNA-fragmenter kan fremstilles i laboratoriet i store mengder.

Utgangsmaterialet for polymerasekjedereaksjonen kalles templat-DNA (dvs. en enkelttrådig DNA-streng som fungerer som mal). Som templat er det nok med ett eneste DNA-molekyl som inneholder den sekvensen man ønsker å amplifisere (mangfoldiggjøre).

Utgangsmaterialet kan være celler eller cellerester fra en person, eller væsker med virus eller bakterier. Materialet kan godt inneholde DNA-molekyler fra mange kilder. Forutsetningen for en amplifikasjon er at man kjenner ca. 20 baser (nukleotider) på hver side av det DNA-segmentet man ønsker å oppkopiere.

På grunnlag av disse sekvensene lages syntetiske oligonukleotider som kalles primere og som er komplementære til det området på templat-DNA hvor disse skal feste seg.

Reaksjonsblandingen inneholder, foruten templat-DNA og primere, alle de fire byggesteinene (nukleotidene) i DNA-molekylet samt et varmestabilt DNA-polymerase-enzym.

Polymerasekjedereaksjonen foregår i tre trinn som gjentas 25–35 ganger (sykluser). Ved første trinn denatureres templat-DNA ved høy temperatur (94 °C) slik at alt DNA blir enkelttrådet. I annet trinn senkes temperaturen, slik at primerne kan hybridisere (feste seg) til de stedene på templat-DNA som har nøyaktig den komplementære sekvensen. Temperaturen heves så til gunstige forhold for enzymet (ca. 72° C), som så syntetiserer en ny DNA-tråd ut fra primerne med templat-DNA som mal. Etter ca. ett minutt er det fra det aktuelle området dannet en kopi av hvert DNA-molekyl som fantes i prøven.

Området som er kopiert, er begrenset på hver side av plasseringen til de to primerne. Etter at dette har skjedd én gang, varmes reaksjonen opp igjen slik at DNA deles til enkelttråder og hele prosessen gjentas.

Det som gjør PCR så anvendelig, er at man lett kan gjenta denne reaksjonen et stort antall ganger (syklisk reaksjon). Ved tilstrekkelig mengde reagenser i reaksjonen vil man for hver syklus fordoble mengden DNA-kopier, mengden av det ønskede DNA-segmentet øker altså eksponentielt. Forandringen av temperaturen skjer automatisk i såkalte PCR-maskiner som kan programmeres slik at man kan variere temperatur og varighet av de enkelte trinnene.

Lengden på fragmentene kan undersøkes i en elektroforese og så kan fragmentene sekvenseres. Av denne grunn har polymerasekjedereaksjon fått meget stor anvendelse både i medisinsk forskning, medisinsk diagnostikk og rettsmedisin.

Spesifikke gener kan analyseres for genvarianter og genfeil, bestemte DNA-fragmenter kan føres tilbake til bestemte individer, og spesifikke virus og bakterier kan identifiseres uten forutgående dyrking.

DNA er relativt stabilt og kan overleve svært lenge, iallfall som bruddstykker av enkelttrådig DNA. Med polymerasekjedereaksjon har man klart å amplifisere DNA fra rester av organismer som er mange millioner år gamle. Dette har åpnet for nye perspektiver når det gjelder å studere artenes utvikling på Jorden.

Prinsippet for metoden ble først beskrevet i 1971 av den norske biokjemikeren Kjell Kleppe (1934–88) og hans medarbeidere, men fikk først sitt gjennombrudd da man klarte å isolere et termostabilt enzym (se Taq-polymerase) og kunne utnytte metoden i diagnostisk sammenheng. Denne utnyttelsen ble belønnet med Nobelprisen i kjemi i 1993. Prisen gikk til den amerikanske biokjemikeren Kary B. Mullis (f. 1944).

• DNA-sekvensering
• DNA-sekvens
• funksjonell genomforskning
• microarray