PCR (polymerasekjedereaksjon)

Utgangsmaterialet for polymerasekjedereaksjonen kalles templat-DNA. Med templat-DNA henvises det til at DNA-molekylet er et makromolekyl som er sammensatt slik at det fungerer som et mønster eller en støpeform for oppbygningen av et nytt DNA-molekyl. Templatet er en enkelt-trådig DNA-streng som fungerer som mal. Som templat er det nok med ett eneste DNA-molekyl som inneholder den sekvensen man ønsker å amplifisere.

Kilden til utgangsmaterialet kan for eksempel være celler eller cellerester fra en person, eller kroppsvæsker med virus eller bakterier. Materialet kan godt inneholde DNA-molekyler fra mange kilder.

For at et spesifikt DNA-segment skal kunne amplifiseres må ca. 20 baser (nukleotider) på hver side av DNA-segmentet være kjent. Det er fordi det trengs en måte å gjenkjenne DNA-segmentet man ønsker å amplifisere på. Disse 20 basene brukes til å lage primere. Primere er syntetiske korte fragmenter av DNA (oligonukleotider) som er komplementære til det området på templat-DNAet hvor disse skal feste seg. Med komplementært vil det si at primeren er identisk til de 20 baseparene på siden av DNA-segmentet man ønsker å identifisere, men at den er satt sammen i motsatt rekkefølge. Reaksjonsblandingen inneholder, foruten templat-DNA og primere, alle de fire byggesteinene (nukleotidene) i DNA-molekylet samt et varmestabilt DNA-polymerase-enzym. En DNA-polymerase katalyserer eller igangsetter dannelsen av en DNA-tråd ved å lese av den komplementære DNA-tråden.

Polymerasekjedereaksjonen foregår i tre trinn som gjentas 25–35 ganger (sykluser):

1. Ved første trinn denatureres templat-DNA ved høy temperatur (94°C) slik at alt DNA blir enkelttrådet.

2. I trinn to senkes temperaturen, slik at primerne kan hybridisere (feste seg) til de stedene på templat-DNA som har nøyaktig den komplementære sekvensen.

3. Temperaturen heves så til gunstige forhold for enzymet (rundt 72°C), som så danner en ny DNA-tråd ut fra primerne med templat-DNA som mal.

Etter omtrent ett minutt har man dannet en kopi av hvert DNA-molekyl som fantes i prøven fra det aktuelle området.

Området som er kopiert, er begrenset på hver side av plasseringen til de to primerne. Etter at dette har skjedd én gang, varmes reaksjonen opp igjen slik at DNA deles til enkelttråder og hele prosessen gjentas.

Det som gjør PCR så anvendelig, er at man lett kan gjenta denne reaksjonen et stort antall ganger (syklisk reaksjon). Ved tilstrekkelig mengde reagenser i reaksjonen vil man for hver syklus fordoble mengden DNA-kopier, mengden av det ønskede DNA-segmentet øker altså eksponentielt. Forandringen av temperaturen skjer automatisk i såkalte PCR-maskiner som kan programmeres slik at man kan variere temperatur og varighet av de enkelte trinnene.

Lengden på fragmentene kan undersøkes i en elektroforese for å bekrefte at korrekt fragment har blitt amplifisert. For å kunne gjøre dette må man vite hva slags lengde det er forventet at fragmentet skal ha, altså hvor mange basepar det inneholder. Fragmentene kan så sekvenseres, det vil si at man benytter seg av en teknikk for å lese av rekkefølgen på de ulike baseparene. Slik vil man for eksempel kunne undersøke om fragmentet koder for et spesifikt gen.

Nettopp fordi PCR-metoden har så høy sensitivitet, at det trengs så lite av utgangsmaterialet kan det være mulig å få feilaktige resultater. Hvis det er forurensning i en prøve, altså at et annet DNA materiale enn det man ønsker å undersøke finnes i prøven, kan feil type DNA amplifiseres. Dette kan føre til et falskt positivt svar. Et falskt positivt svar vil si at hvis man for eksempel ønsker å undersøke om det er en spesifikk type DNA-materiale til stede i en prøve eller ikke, kan man detektere DNA amplifisert fra forurensingen og ikke fra det materialet man ønsker å indentifisere. Da har man fått et falskt positivt svar. Dette kan for eksempel skje på et sykehuslaboratorium. Hvis det finnes DNA-materiale fra en bestemt type DNA fra en bakterie og dette DNA-materialet har havnet i en reagens som brukes i PCR-reaksjonen, kan man detektere dette DNA-materialet selv om prøven som ble tatt ikke opprinnelig inneholdt DNA fra denne bakterien. Slik kan en pasient få påvist en infeksjon selv om pasienten i virkeligheten er frisk. Det er strenge rutiner på plass som forhindrer at slike falske positive resultater forekommer. Et av disse tiltakene innebærer å bruke negative og positive kontroller i PCR-reaksjonen. En negativ kontroll kan være en PCR-reaksjon som kun består av reagensene som trengs til reaksjonen, uten prøvemateriale. Hvis DNA-materiale påvises i denne negative kontrollen, er det et tegn på at en av reagensene kan være forurenset, og PCR-reaksjonen må gjøres på nytt med nye reagenser før prøvesvaret kan utgis. På tilsvarende måte brukes en positiv kontroll for å undersøke at PCR-reaksjonen har fungert på korrekt måte, for å unngå at en pasient får et falskt negativt svar. Det vil si at DNA-materiale i en prøve fra pasient som har en infeksjon ikke har blitt identifisert fordi det har skjedd en feil under PCR-reaksjonen slik at mengden DNA ikke har blitt amplifisert til en mengde som kan detekteres. En positiv kontroll er i dette tilfellet en PCR-reaksjon som inneholder alle de nødvendige reagensene, men istedenfor en del av en pasientprøve tilsettes det DNA materiale direkte. Slik vet man at det skal finnes DNA i en viss mengde etter PCR reaksjonen. Hvis dette ikke er tilfellet, må PCR-reaksjonen gjøres på nytt.

Anvendelse Polymerasekjedereaksjon har fått meget stor anvendelse både i medisinsk forskning, medisinsk diagnostikk og rettsmedisin.Spesifikke gener kan analyseres for genvarianter og genfeil, bestemte DNA-fragmenter kan føres tilbake til bestemte individer, og spesifikke virus og bakterier kan identifiseres uten forutgående dyrking.DNA er relativt stabilt og kan overleve svært lenge, iallfall som bruddstykker av enkelt-trådig DNA. Med polymerasekjedereaksjon har man klart å amplifisere DNA fra rester av organismer som er mange millioner år gamle. Dette har åpnet for nye perspektiver når det gjelder å studere artenes utvikling på Jorden.Under Covid-19 pandemien var en spesifikk PCR-metode, kjent som real-time revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR), avgjørende for hurtig diagnostikk av Covid-19 virusinfeksjoner.

Prinsippet for metoden ble først beskrevet i 1971 av den norske biokjemikeren Kjell Kleppe (1934–1988) og hans medarbeidere, men fikk først sitt gjennombrudd da man klarte å isolere et termostabilt enzym (Taq-polymerase). Tidligere måtte man tilsette nytt polymerase-enzym ved hver eneste syklus av PCR-reaksjonen da enzymet ble ødelagt ved oppvarming til 94°C. Når Taq-polymerasen ble oppdaget i bakterien Thermus aquaticus og tatt i bruk i PCR-reaksjonen i 1988 ble metoden både mer effektiv og mer treffsikker. Det var fordi Taq-polymerasen kunne varmes opp til 95°C flere ganger, og funksjonen til enzymet var meget stabilt ved høye temperaturer. Dette førte til at man kunne utnytte metoden i diagnostisk sammenheng. Denne utnyttelsen ble belønnet med Nobelprisen i kjemi i 1993. Prisen gikk til den amerikanske biokjemikeren Kary B. Mullis (1944-2019).

• DNA-sekvensering
• DNA-sekvens
• funksjonell genomforskning
• microarray